Слайды и текст доклада
Pic.1
Фотометрические методы биохимического анализа
Pic.3
Методы сравнения стандартного и опытного образца Анализируемая и стандартная проба обрабатываются в одинаковых условиях При больших сериях – стандартную пробу исследовать в начале серии и через …
Pic.4
Методы определения без использования калибратора Фотометрические единицы (в случае отсутствия калибратора – средние молекулы, серомукоид) – оптическую плотность умножают на 100 (D = 0,3, ответ – 30 …
Pic.5
Методы определения без использования калибратора Определение концентрации по молярному показателю поглощения – применение закона Бургера С = D/lхξ (концентрация определяется делением измеренной …
Pic.6
Спектральные характеристики хромогенов
Pic.7
Примеры: Определение концентрации НАДН на основе определения оптической плотности Молярный показатель НАДН при 340 нм 6,22х10 3 лхмоль -1см-1. (ввести верхний символ). Измерена оптическая плотность в …
Pic.8
Измерение скорости изменения поглощения Фотометрические измерения проводят непосредственно при протекании реакции Потребление субстратов Повышение концентрации продуктов Изменение кофакторов …
Pic.10
Сопряженные реакции
Pic.11
При кинетическом определении вычисляют изменение поглощения за 1 минуту F
Pic.12
Единицы активности ферментов Катал – количество фермента, превращающего 1 моль субстата за 1 сек МЕ - количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстата за 1минуту МЕ/л↔0,0167 мккат/л или МЕ/л↔16,7 …
Pic.13
Измерение по конечной точке Реакция развивается за некоторый период времени и достигает определенного конечного состояния (конечная точка) При измерении по конечной точке уровень сигнала …
Pic.14
1-точечное измерение на двухлучевом фотометре Измерение ведется в режиме сравнения растворов в двух кюветах В каждую кювету вносится одинаковое количество реактива, в 1-ую – проба с известной …
Pic.15
Измерение с бланком на однолучевом фотометре Для исключения систематического влияния (рабочий реактив, отражение от стенок кювет, темновой ток) используют измерение относительно холостой пробы …
Pic.16
Рабочая таблица для определения концентрации методом измерения с бланком по рабочему реактиву
Pic.17
Измерение с прозоной Разновидность измерения с бланком Измерение в одной кювете, отсутствует кювета сравнения Проводят определение до прибавления биопробы Характерен для биохимических анализаторов …
Pic.18
Двухволновое измерение с опорной длиной волны Необходимо для исключения мешающих факторов (гемолиз, иктеричность, липемичность, использование исчерченных кювет) Измерение проводят на 2 длинах волн – …
Pic.19
Принцип получения информации о степени иктеричности, липемичности и гемолиза сывортки 20 мкл сыворотки, смешать с 200 мкл дистиллированной воды, добавить 600 мкл 0,15 М фосфатный буфер (рН = 7,4) …
Pic.21
Кинетические измерения Определение меняющейся в ходе реакции оптической плотности Широко используется для определения активности ферментов Требует точного поддержания температуры в измерительной …
Pic.22
Корректирующие температурные коэффициенты для активности ферментов
Pic.23
Измерение по кинетике
Pic.24
Измерение по двум точкам При постоянной скорости кинетической реакции измерение можно проводить на любом отрезкелинейной кривой, приводя поглощение к 1 мин. Достоинства – простота, возможность …
Pic.25
Измерение по двум точкам Возможны методические ошибки Если реакция начинается с очень высокой скоростью, то она может замедлиться или прекратиться из-за потребления всего субстрата. Несоответствие …
Pic.26
Измерение по двум точкам Реакция может задержаться на старте (Lag-фаза в мультиферментных системах) Обусловлена, по-видимому, задержкой образованием фермент-субстратного комплекса. Может продолжаться …
Pic.27
Многоточечное измерение Позволяет оценивать характер кинетики и выбирать для расчетов линейный участок Является наиболее точным методом определения активности ферментов Изменение оптического …
Pic.28
Многоточечное измерение Измерение по начальной скорости Скорость увеличивается в зависимости от количества фермента при одинаковой начальной концентрации субстрата Возникает в случае малого …
Pic.29
Измерение по начальной скорости Измерение скорости реакции. Регистрируется изменение в каждый момент времени светопропускания. Показатель, соответствующий максиальной скорости – значение максимальной …
Pic.30
Многоточечное измерение Кинетический метод с коррекцией по бланку образца Используется для определения активности ферментов и количественного измерения концентрации субстратов Одновременно может …
Pic.31
Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения реакции после добавления дополнительного количества антигена –малые дозы калибратора) При …
Pic.32
Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Pic.33
Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование
Pic.34
Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование
Pic.35
Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование
Pic.36
Волоконный световод минимизирует оптическую схему
Pic.38
Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование
Pic.39
Рассеяние света Мутный раствор в кювете - поглощает свет (если окрашен) - частично проходит, не изменяя направления (трансмиссия) - частично рассеивается, изменяя направление под различными углами …
Pic.40
Рассеяние света Трансмиссия и рассеивание зависят от - длины волны светового потока - частоты светового потока - интенсивности светового потока - свойств рассеивающей среды (размера и формы частиц, …
Pic.41
Определение светорассеивания Зависит от длины волны (λ) Диаметра частиц, на которых происходит рассеивание Если размер частиц значительно меньше длины волны светового потока (<λ/10) – упругое …
Pic.42
Интенсивность потока, рассеиваемого небольшими частицами, подчиняется уравнению Релея
Pic.43
В основе рассеяния малых частиц лежит явление дифракции Рассеяние света каждой частицей не зависит друг от друга. Рассеянный свет распространяется во всех направлениях Максимальное количество света …
Pic.44
При увеличении размеров частиц (40-400 нм)рассеивание становится несимметричным Максимальное количество света рассеивается в направлении падающего луча При λ 400нм (Ig M, хиломикроны, формирующиеся …
Pic.45
При превышении длины света (диаметр > 400 нм) несимметричность светорассеяния увеличивается Характерен для взвеси бактерий, клеток крови (тромбоциты, эритроциты)
Pic.46
Нефелометрия Измерение рассеянного света Сравнивая величины рассеянного и падающего света можно определять концентрацию вещества в растворе
Pic.47
Оптическая схема нефелометра
Pic.48
Турбидиметрия Измерение прошедшего света Турбидиметры построены по типу фотометров
Pic.49
Турбидиметрия Выражение, подобное закону Бугера-Ламберта для окрашенных растворов t – молярный коэффициент мутности раствора (турбидность) В качестве турбидиметров можно использовать большинство …
Pic.50
Турбидиметрия и нефелометрия Используются для определения индивидуальных белков Особенность – построение калибровочного графика с использованием не менее пяти концентраций (калибровочный график имеет …
Pic.51
Кривая доза-эффект При взаимодействии антиген-антитело образуют агрегаты
Pic.52
Кривая доза-эффект При пропорциональной концентрации антигенов и антител комплекс выпадает в осадок – преципитат. В супернатанте не определяются антитела и антигены – эквивалентное состояние
Pic.53
Кривая доза-эффект При увеличении концентрации антигенов количество антител недостаточно для полного связывания белка. Частицы иммунных комплексов становятся мелкими, преципитат не формируется. В …
Pic.54
Кривая доза-эффект Классическая преципитационная кривая Хайдельберга-Кендаля
Pic.55
Калибровочный график Строится для -каждого индивидуального белка -каждого прибора -при любом условий регистрации -периодически при проведении исследований При серийных исследованиях в стандартных …
Pic.56
Состав реакционной смеси подбирается так, чтобы измерение производилось в зоне избытка антител. При очень высокой концентрации белка антител недостаточно, частицы преципитата становятся мелкими …
Pic.57
Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения реакции после добавления дополнительного количества антигена –малые дозы калибратора) При …
Pic.59
КЛИНИЧЕСКИЙ СПЕКТРОФОТОМЕТР
Pic.61
Кормей-мульти – программируемый фотометр с проточной кюветой
Pic.63
Спектр поглощения производных гемоглобина
Скачать презентацию
Если вам понравился сайт и размещенные на нем материалы, пожалуйста, не забывайте поделиться этой страничкой в социальных сетях и с друзьями! Спасибо!